近日，华南师范大学环境学院应光国教授团队2021级硕士李思颖、2020级博士生马栋栋、史文俊副研究员等人在《Environmental Science & Technology》上发表了题为“New Psychoactive Substance Esketamine Causes Endocrine Disruption Effect and Developmental Toxicity”的论文（DOI:10.1021/acs.est.5c00589）。该研究通过新精神活性物质S-ketamine（ESK）短期暴露斑马鱼胚胎和成纤维ZF4细胞24小时以及暴露幼鱼14天，发现环境相关浓度下ESK对斑马鱼具有内分泌干扰效应和发育毒性。
图文摘要
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S-ketamine（ESK）是一种具有强致幻作用的新精神活性物质，已在全球地表水中被检出。目前环境浓度下ESK对鱼类的毒性效应尚不明确。本研究首先以斑马鱼胚胎和ZF4细胞为模型，暴露于ESK（0、0.12、1.02和10.6 µg/L，标记为SC、LC、MC和HC组）24小时。ESK-LC和ESK-MC显著增加胚胎面积及卵黄囊的长度、高度和体积，而ESK-HC则呈现相反作用。ESK-LC和ESK-MC在暴露24小时后明显上调卵黄蛋白原（vtg）的转录与表达水平，并干扰细胞周期。其次，暴露14天后，KEGG分析显示昼夜节律、核苷酸切除修复和雌激素信号通路是受影响最显著的前三条通路。分子对接分析表明，ESK与雌激素受体具有较高亲和力，这与实验中观测到的VTG水平显著升高现象一致。本研究证实ESK对斑马鱼具有发育毒性和内分泌干扰效应，需要评估其对鱼类生态毒性。
引言
新精神活性物质是一类未被《1961年麻醉品单一公约》或《1971年精神药物公约》列管、但对公众健康构成威胁的滥用物质。(R,S)- ketamine（KET）作为NPS中的解离麻醉剂，具有诱发强烈视听分离感和欣快感的独特作用。KET由两种光学对映体等比例构成，即S- ketamine（即ESK）与R- ketamine。其中ESK的麻醉效力是KET的2倍。值得注意的是，2020年美国医疗补助计划中ESK的使用量已超越KET。
现有研究主要聚焦KET/ESK滥用导致的健康风险，针对KET/ESK水生生物效应及潜在生态风险与毒性机制的研究较为匮乏。受污水处理技术限制，KET的表观去除率不足50%，最终残留物进入受纳水体。KET在自然状态下难通过挥发、吸附、水解和生物降解等途径消除，自然衰减率极低。目前全球多国地表水均检出KET，其浓度在马来西亚污水进水口达273 ng/L，中国海口市污水进出水口分别高达930 ng/L和1100 ng/L。中国深圳河地表水KET浓度达130~275 ng/L，而台湾某音乐节后周边地表水与废水中更检出9.53 µg/L和138 µg/L的峰值。更重要的是，已有研究证实KET（含ESK）具有生物蓄积潜力。
KET/ESK的持续排放对鱼类具有潜在风险。最新研究表明，KET/ESK对斑马鱼具有神经毒性和发育毒性。此外，KET能与雌激素受体（ER）结合，提示其可能具有内分泌干扰效应。鉴于KET/ESK的高毒性及地表水中的显著残留浓度，亟需在环境相关浓度下评估ESK对鱼类的生态毒性。本研究采用体内-体外实验探究ESK对斑马鱼的毒性：1）鉴于ZF4细胞系源于24 hpf胚胎，ESK首先暴露ZF4细胞（in vitro）与斑马鱼胚胎（in vivo）24小时，测定胚胎及卵黄囊尺寸，分析细胞周期变化和细胞增殖速度；2）为探究ESK对幼鱼的影响，ESK继续暴露胚胎至14天，统计幼鱼死亡率、孵化率、致畸率等生长发育指标，聚焦显著富集生物学通路，阐述ESK对幼鱼的毒性效应机制。本研究将为科学评估环境相关浓度下ESK对斑马鱼早期发育阶段的生态毒性提供了研究基础。
图文导读
1.ESK导致斑马鱼胚胎和卵黄囊发育异常
ESK-MC组显著增大斑马鱼胚胎直径和体积，而ESK-HC组则呈现相反效应（图1A-C，图S2）。类似地，ESK-LC和ESK-MC明显增加胚胎面积，ESK-HC则降低胚胎面积（图1D、E，图S2）。在卵黄囊发育方面，ESK-LC和ESK-MC显著增加其长度、高度及体积（图1F-I，图S2）；相反，ESK-HC明显降低卵黄囊长度、高度和体积（图1F-H，图S2）。
为深入探究ESK对卵黄囊的影响，我们检测了胚胎和ZF4细胞中卵黄蛋白原（VTG）的表达水平。结果显示：ESK-LC和ESK-MC均上调vtg1基因转录（in vivo），而ESK-HC在体内和体外均表现抑制作用（图1J）。生物标志物VTG的浓度变化与vtg1转录趋势一致——三个ESK处理组在胚胎和ZF4细胞中均呈现显著性差异的结果（图1K、L）。
Figure 1. Effects of ESK on zebrafish embryo morphology and the levels of VTG transcription and expression in both embryos and ZF4 cells.
图1. ESK对斑马鱼胚胎形态及胚胎和ZF4细胞中VTG转录表达水平的影响
2.ESK干扰细胞周期并抑制ZF4细胞增殖
体内实验显示，ESK对G0/G1期细胞数量具有显著影响（图2A、B，图S3）。LC和MC组G0/G1期细胞数量增加，表明ESK使胚胎细胞阻滞于G0/G1期；而HC组则呈现相反趋势。体外实验同样发现，LC和MC组的ESK显著增加ZF4细胞G0/G1期细胞数量，同时减少S期和G2/M期细胞数量（图2C-D，图S3），证实ESK在低中浓度下可诱导细胞周期阻滞。与之相反，HC组G0/G1期细胞比例显著降低。这些结果表明ESK在体内外均能显著干扰细胞周期进程。
为探究ESK对细胞增殖的影响，我们采用EdU染色法检测ZF4细胞增殖情况。结果显示，LC和MC组的ESK显著降低EdU阳性细胞比例（图2E-F，图S4），而HC组则呈现相反结果，表明ESK在低中浓度抑制细胞增殖，在高浓度则呈现促进作用。
为解析分子机制，我们通过RNA测序分析评估了ESK暴露24小时后对斑马鱼胚胎（in vivo）和ZF4细胞（in vitro）转录组的影响。暴露ZF4细胞后，KEGG分析显示，在ESK-HC组（in vitro）中，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是受影响最显著的通路，此外剪接体、内质网蛋白质加工及内吞作用通路也明显改变（图2G）。差异表达基因（DEGs）分析发现，hsp70.1、hsp70.2、hsp70l和dusp5（分别上调1.21倍、1.60倍、1.19倍和1.16倍）在MAPK通路中显著富集（图S5）。
暴露斑马鱼胚胎24小时后，MAPK通路相关基因（hsp70.1、hsp70.2、hsp70l和dusp5）与生长发育相关基因（egr4、kpna7、org、vtg1、vtg2、apobec2b和ccdc3a）显著富集（图S5）。蛋白质互作网络分析表明，胚胎中MAPK通路基因与生长发育基因存在多重功能关联，提示MAPK信号通路与胚胎发育密切相关。通过qPCR对hsp70.1、hsp70.2、hsp70l和dusp5等关键基因在ESK各浓度组（in vivo and in vitro）的表达进行验证，结果与RNA测序数据一致（图2H）。
Figure 2. Effects of ESK on cell cycle, ZF4 cell proliferation and transcriptome analysis (24 hpf).
图2. ESK对细胞周期、ZF4细胞增殖、转录组学分析的影响
3.ESK导致14 dpf斑马鱼幼鱼形态异常
在14 dpf的斑马鱼幼鱼中，观察到ESK暴露导致多种形态异常（图3A），包括脊柱弯曲（LC和MC组）、尾部水肿（LC和HC组）、心包水肿（MC组）和卵黄囊水肿（HC组）。随着暴露浓度升高，ESK显著增加了14 dpf幼鱼的畸形率，同时减小体长和体重（图3B-D）。在发育早期，ESK显著降低48 hpf孵化率，并增加LC组96 hpf的死亡率（图S6）。
Figure 3. Effects of ESK on the 14 dpf zebrafish larvae development.
图3. ESK对14 dpf斑马鱼幼鱼发育的影响
4.ESK具有内分泌干扰效应
14 dpf的KEGG富集分析显示，昼夜节律、核苷酸切除修复和雌激素信号通路是受影响最显著的前三条通路。通过qPCR对雌激素信号通路、昼夜节律和核苷酸切除修复相关差异表达基因的检测，验证了14 dpf幼鱼的RNA测序结果（图4B、C）。相应地，随着暴露浓度增加，ESK显著提高14 dpf幼鱼的卵黄蛋白原（VTG）水平，同时降低雌二醇（E2）水平（图4D、E）。值得注意的是，ESK与cry5、esr2b、esr2a和hsp70.1蛋白的结合能较低（数值< -7）（图4H），并与esr2a、esr2b形成π-π堆叠作用（图4F、G）。这些结果与24 hpf的数据（图1）共同表明，ESK具有内分泌干扰效应。
Figure 4. Effects of ESK on transcriptome analysis and hormone levels in 14 dpf larvae.
图4. ESK对14 dpf幼鱼转录组分析和激素水平的影响
结论与意义
ESK作为一种新精神活性物质，在生活污水及受纳水环境中被广泛检出。现有研究主要关注滥用后高浓度ESK对哺乳动物的多重毒性，而环境浓度下ESK对鱼类的毒性机制尚不明确。本研究表明，环境相关浓度的ESK可诱发斑马鱼胚胎发育异常及内分泌干扰效应。通过结合体内外实验发现，24 h急性暴露导致斑马鱼卵黄囊和胚胎发育异常，干扰细胞周期；持续暴露至14 dpf的实验进一步揭示，ESK不仅能诱发畸形表型，还干扰E2和VTG水平变化，与斑马鱼雌激素受体具有较强亲和力，表现雌激素效应。胚胎早期发育异常会影响鱼类生长、行为乃至生存能力。鉴于该物质在环境中的广泛存在，需要评估ESK等精神活性物质对鱼类的生态风险。
全文链接
Si-Ying Li, Dongdong Ma, Wen-Jun Shi, Jin-Ge Zhang, Bo Tang, Zhi-Jie Lu, Chong-Rui Yao, Xiao-Bing Long, Xin Liu, Chu-Shu Huang, Guang-Guo Ying. New Psychoactive Substance Esketamine Causes Endocrine Disruption Effect and Developmental Toxicity. Environmental Science & Technology, 2025, 59, 8417-8427.
Li S-Y, Shi W-J, Ma D-D, et al. Effects of New Psychoactive Substance Esketamine on Behaviors and Transcription of Genes in Dopamine and GABA Pathways in Zebrafish Larvae [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2024, 112: 51.